LIC 법

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Ligation Independent Cloning 으로서

conventional cloning 처럼 제한효소로 Short sticky ends를 만드는 대신, T4 DNA polymerase로 long sticky ends(12-15)를 만들어서 ligation 없이도 잘 붙어있게 만든다.

즉, Ligation 과정이 필요없다.

제한효소에 의해 생긴 말단의 Stickiness는 매우 적은 노출된 뉴클레오티드 사이의 수소결합 수에 비례하기 때문에 매우 약하다. DNA ligase의 인산골격 공유결합이 이를 안정화 시킨다.

반대로 T4P-LIC에 의해 생긴 long sticky ends의 Stickiness는 스스로 삽입되고 붙잡을 수 있을 정도로 충분하고, 이는 tranformation 되서 host cell의 ligase에 의해 처리된다.

T4 DNA pol는 5'-3' polymerase랑 3'-5' exonuclease activity를 가지고 있는데 후자를 이용.

노출된 3말단이 T4 DNA pol의 exonuclease activity를 일어나게 해서 뉴클레오티드 제거하게함

3말단에 뉴클레오티드를 넣어줌으로서 exonuclease activity의 balance를 유지한다. 4 dNTPs를 넣어주면 종합적으로서는 아무런 일이 일어나지 않는다.

T4P-LIC 시스템은 벡터의 클로닝 사이트를 왼쪽 18개까지는 no adenine, 오른쪽 16개까지는 no adenine으로 만들고 dATP만 넣어주기 때문에

왼쪽 18개, 오른쪾 16개가 비어있는 말단이 생긴다.

insert는 비슷한 방법으로 진행된다. T4 pol이랑 dTTP로 만들어진 oligo tail을 이용해서 PCR로 증폭시켜서 벡터에 compatible한 overhang을 만든다.

vector와 insert는 simply annealled되고 trasformed된다. 왜냐면 왼쪽 오른쪽이 달라서 방향성이 있기 때문이다.

T4P-LIC의 장점은 단순하고 빠르고 성공률이 높다