2.14

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transformation

시킴 250 중 100 도말

affinity chromatography를 통한 단백질 정제(large scale)

affinity chromatography 중 하나인 IMAC(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)를 사용

cf) IMAC은 프로테인에 친화력이 있는 니켈과 같은 금속이온을 사용하여 컬럼을 만드는 것이다. 히스티딘의 질소의 비공유전자쌍이 도너가 되어서 니켈 이온과 공유 결합을 한다. 우리의 프로테인의 말단에 홀리히스티딘(히스티딘 여러개)를 붙여서 고정상에 붙도록 한다. 크로마토그래피 후 일루션 할 때는, 보다 친화력이 높은 금속이온의 리간드 역할을 하는 IMIDAZOLE을 넣어서 단백질을 금속으로 부터 분리시킨다. IMIDAZOLE은 최소 200mM 되는 것을 써야한다.

1. 냉동시켯던 Large scale cell을 pH 8.0 버퍼에 현탁시킨다.

2. cell lysis by sonicfication/초음파

cf) 초음파 쬘 때, 비커가 깨질 수 있으니 얼음에 박은 상태로 4분 하고 식히고 4분하고 식히고 4분하고 식히고 이렇게 한다. sonification 후엔 OD가 작아져서 보다 투명해진다.

3. 60min centrifuge 후 soup 을 마이크로필터로 여과한 것을

4. washing buffer로 안정화시킨 chromatography에 넣어줌

5. 기포가 생기지 않게 protein이 다 닳기 전에 멈춘 후 washing buffer 로 다시 안정화 안정화 후 elution

6.전기영동

7. 결과