단백질발현실험
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1. Taq DNA pol.의 유전자앞에 lactose induced promoter를 붙인, 시스트론을 가진, 플라스미드를 가진 E.coli 를 LBA plate 도말 | 1. Taq DNA pol.의 유전자앞에 lactose induced promoter를 붙인, 시스트론을 가진, 플라스미드를 가진 E.coli 를 LBA plate 도말 | ||
Revision as of 09:26, 18 July 2013
1. Taq DNA pol.의 유전자앞에 lactose induced promoter를 붙인, 시스트론을 가진, 플라스미드를 가진 E.coli 를 LBA plate 도말
2. single cell 3ml를 LBA broth 에 overnight
3. LB broth 1L 에 scale up
4. 약 3시간 후 OD가 0.5정도 되면 Lactose(IPTG) induction
cf) OD가 0.5정도라는 것은 세균의 개체수가 증가하고 있을 시기로, 이 시기에 단백질을 발현 시키면 가장 많은 양을 얻을 수 있다.
cf) lactose 유사화합물은 IPTG를 쓰면 IPTG를 영양분으로 분해하지 못하고 계속 프로모터에 붙어있어서 과발현을 유도할 수 있다.
5. 3~6시간 후 cell harvest
cell harvest : large scale - 500ml bottle 두개에 옮겨 담아서 원심분리 후 냉동보관
cell harvest : small scale - 500 마이크로L 만 따로 떠서 원심분리
6. cell Lysis : small scale ; lysis 용액인 bugbuster 100 마이크로L 에 현탁 후 30분 상온보관, 원심분리 10분(!)
7. protein gel loading : SDS-PAGE ;
-soluble과 insoluble+buffer 100마이크로L 준비
-protein 20 마이크로L + 5*sample buffer 5 마이크로L
-HEAT ; denature 5min at 95`c
-1초 spin down
200V, 50min
-instant blue로 염색
-로딩결과 원하는 단백질로 추정되는 soluble protein이 보임
cf) 원심분리(!) 하는 이유 : 단백질이 제대로 발현됬으면 soluble이기 때문에, 그리고 변성을 막기위해 4`C 쿨링 centrifuge 로