단백질발현실험
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| + | ==5*sample buffer== | ||
| + | Tris-HCl(pH 6.0) : 버퍼 | ||
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| + | glycerol : 단백질 가라앉히기 | ||
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| + | SDS : 단백질 2차구조 형성 억제, 음전하 붙여주기 | ||
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| + | bromophenol blue : 진행정도 확인 | ||
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| + | ==PAGE gel만들기== | ||
| + | 단백질의 크기가 클수록 낮은 %의 gel을 사용한다. | ||
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| + | 준비물 : running gel과 stocking gel | ||
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| + | stocking gel을 좀 더 늦게 만든다-APS랑 TEMED가 굳게 해주는 애니깐 이걸 나중에 넣는다. | ||
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| + | 1.running gel을 넣고 에탄올로 수평을 맞춰주고 | ||
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| + | 2.굳으면 에탄올 버리고 | ||
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| + | 3.stacking gel 넣고 | ||
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| + | 4.월을 넣는다. | ||
| + | ==affinity chromatography를 통한 단백질 정제(large scale)== | ||
| + | affinity chromatography 중 하나인 IMAC(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)를 사용 | ||
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| + | cf) IMAC은 프로테인에 친화력이 있는 니켈과 같은 금속이온을 사용하여 컬럼을 만드는 것이다. 히스티딘의 질소의 비공유전자쌍이 도너가 되어서 니켈 이온과 공유 결합을 한다. 우리의 프로테인의 말단에 홀리히스티딘(히스티딘 여러개)를 붙여서 고정상에 붙도록 한다. 크로마토그래피 후 일루션 할 때는, 보다 친화력이 높은 금속이온의 리간드 역할을 하는 IMIDAZOLE을 넣어서 단백질을 금속으로 부터 분리시킨다. IMIDAZOLE은 최소 200mM 되는 것을 써야한다. | ||
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| + | 1. 냉동시켯던 Large scale cell을 pH 8.0 버퍼에 현탁시킨다. | ||
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| + | 2. cell lysis by sonicfication/초음파 | ||
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| + | cf) 초음파 쬘 때, 비커가 깨질 수 있으니 얼음에 박은 상태로 4분 하고 식히고 4분하고 식히고 4분하고 식히고 이렇게 한다. sonification 후엔 OD가 작아져서 보다 투명해진다. | ||
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| + | 3. 60min centrifuge 후 soup 을 마이크로필터로 여과한 것을 | ||
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| + | 4. washing buffer로 안정화시킨 chromatography에 넣어줌 | ||
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| + | 5. 기포가 생기지 않게 protein이 다 닳기 전에 멈춘 후 washing buffer 로 다시 안정화 | ||
| + | 안정화 후 elution | ||
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| + | 6.전기영동 | ||
Latest revision as of 03:23, 22 July 2013
1. Taq DNA pol.의 유전자앞에 lactose induced promoter를 붙인, 시스트론을 가진, 플라스미드를 가진 E.coli 를 LBA plate 도말
2. single cell 3ml를 LBA broth 에 overnight
3. LB broth 1L 에 scale up
4. 약 3시간 후 OD가 0.5정도 되면 Lactose(IPTG) induction
cf) OD가 0.5정도라는 것은 세균의 개체수가 증가하고 있을 시기로, 이 시기에 단백질을 발현 시키면 가장 많은 양을 얻을 수 있다.
cf) lactose 유사화합물은 IPTG를 쓰면 IPTG를 영양분으로 분해하지 못하고 계속 프로모터에 붙어있어서 과발현을 유도할 수 있다.
5. 3~6시간 후 cell harvest
cell harvest : large scale - 500ml bottle 두개에 옮겨 담아서 원심분리 후 냉동보관
cell harvest : small scale - 500 마이크로L 만 따로 떠서 원심분리
6. cell Lysis : small scale ; lysis 용액인 bugbuster 100 마이크로L 에 현탁 후 30분 상온보관, 원심분리 10분(!)
7. protein gel loading : SDS-PAGE ;
-soluble과 insoluble+buffer 100마이크로L 준비
-protein 20 마이크로L + 5*sample buffer 5 마이크로L
-HEAT ; denature 5min at 95`c
-1초 spin down
-marker랑 같이 로딩 ;
200V, 50min
-instant blue로 염색
-로딩결과 원하는 단백질로 추정되는 soluble protein이 보임
cf) 원심분리(!) 하는 이유 : 단백질이 제대로 발현됬으면 soluble이기 때문에, 그리고 변성을 막기위해 4`C 쿨링 centrifuge 로
5*sample buffer
Tris-HCl(pH 6.0) : 버퍼
glycerol : 단백질 가라앉히기
SDS : 단백질 2차구조 형성 억제, 음전하 붙여주기
2-merchapto ethanol
bromophenol blue : 진행정도 확인
H20
PAGE gel만들기
단백질의 크기가 클수록 낮은 %의 gel을 사용한다.
준비물 : running gel과 stocking gel
stocking gel을 좀 더 늦게 만든다-APS랑 TEMED가 굳게 해주는 애니깐 이걸 나중에 넣는다.
1.running gel을 넣고 에탄올로 수평을 맞춰주고
2.굳으면 에탄올 버리고
3.stacking gel 넣고
4.월을 넣는다.
affinity chromatography를 통한 단백질 정제(large scale)
affinity chromatography 중 하나인 IMAC(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)를 사용
cf) IMAC은 프로테인에 친화력이 있는 니켈과 같은 금속이온을 사용하여 컬럼을 만드는 것이다. 히스티딘의 질소의 비공유전자쌍이 도너가 되어서 니켈 이온과 공유 결합을 한다. 우리의 프로테인의 말단에 홀리히스티딘(히스티딘 여러개)를 붙여서 고정상에 붙도록 한다. 크로마토그래피 후 일루션 할 때는, 보다 친화력이 높은 금속이온의 리간드 역할을 하는 IMIDAZOLE을 넣어서 단백질을 금속으로 부터 분리시킨다. IMIDAZOLE은 최소 200mM 되는 것을 써야한다.
1. 냉동시켯던 Large scale cell을 pH 8.0 버퍼에 현탁시킨다.
2. cell lysis by sonicfication/초음파
cf) 초음파 쬘 때, 비커가 깨질 수 있으니 얼음에 박은 상태로 4분 하고 식히고 4분하고 식히고 4분하고 식히고 이렇게 한다. sonification 후엔 OD가 작아져서 보다 투명해진다.
3. 60min centrifuge 후 soup 을 마이크로필터로 여과한 것을
4. washing buffer로 안정화시킨 chromatography에 넣어줌
5. 기포가 생기지 않게 protein이 다 닳기 전에 멈춘 후 washing buffer 로 다시 안정화 안정화 후 elution
6.전기영동
