단백질발현실험

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단백질발현실험

1. Taq DNA pol.의 유전자앞에 lactose induced promoter를 붙인, 시스트론을 가진, 플라스미드를 가진 E.coli 를 LBA plate 도말

2. single cell 3ml를 LBA broth 에 overnight

3. LB broth 1L 에 scale up

4. 약 3시간 후 OD가 0.5정도 되면 Lactose(IPTG) induction

cf) OD가 0.5정도라는 것은 세균의 개체수가 증가하고 있을 시기로, 이 시기에 단백질을 발현 시키면 가장 많은 양을 얻을 수 있다.

cf) lactose 유사화합물은 IPTG를 쓰면 IPTG를 영양분으로 분해하지 못하고 계속 프로모터에 붙어있어서 과발현을 유도할 수 있다.

5. 3~6시간 후 cell harvest

cell harvest : large scale - 500ml bottle 두개에 옮겨 담아서 원심분리 후 냉동보관

cell harvest : small scale - 500 마이크로L 만 따로 떠서 원심분리

6. cell Lysis : small scale ; lysis 용액인 bugbuster 100 마이크로L 에 현탁 후 30분 상온보관, 원심분리 10분(!)

7. protein gel loading : SDS-PAGE ;

-soluble과 insoluble+buffer 100마이크로L 준비

-protein 20 마이크로L + 5*sample buffer 5 마이크로L

-HEAT ; denature 5min at 95`c

-1초 spin down

-marker랑 같이 로딩 ;

200V, 50min

-instant blue로 염색

-로딩결과 원하는 단백질로 추정되는 soluble protein이 보임

cf) 원심분리(!) 하는 이유 : 단백질이 제대로 발현됬으면 soluble이기 때문에, 그리고 변성을 막기위해 4`C 쿨링 centrifuge 로